摘要：目的探讨藤茶总*酮（totalflavonoidsfromAmpelopsisgrossedentata，AGTF）对高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）肾功能损伤的保护机制。方法利用分子对接技术，将藤茶总*酮主要活性成分与HUA相关靶点蛋白尿酸重吸收转运体1（uricacidreabsorptiontransporter1，URAT1）、葡萄糖转运蛋白9（glucosetransporter9，GLUT9）、三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2（adenosinetriphosphatebindingcassettetransporterG2，ABCG2）、*嘌呤氧化酶（xanthineoxidase，XOD）和腺苷脱氨酶（adenosinedeaminase，ADA）进行分子对接。采用腺嘌呤联合乙胺丁醇复合方法制备HUA肾功能损伤大鼠模型，以AGTF进行干预，检测大鼠血清中尿酸代谢酶XOD和ADA活性、尿酸以及肾功能生化指标肌酐和尿素氮的水平；苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠肾脏组织病理变化；Westernblotting法检测大鼠肾组织中肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）蛋白的表达；免疫组化法检测大鼠肾组织中URAT1、GLUT9和ABCG2蛋白的表达。结果分子对接结果表明，AGTF主要活性成分二氢杨梅素、杨梅素、槲皮素和藤茶素与疾病相关靶点对接得分均较高，提示AGTF可能通过干预URAT1、GLUT9、ABCG2、ADA和XOD发挥抗HUA肾功能损伤的作用。AGTF能显著降低HUA肾功能损伤模型大鼠血清中XOD和ADA的活性以及尿酸、肌酐、尿素氮的水平（P＜0.05、0.01）。HE染色结果显示，AGTF能缓解模型大鼠肾小球基底膜增厚，减轻肾小管排列紊乱及坏死，抑制病变区域内纤维组织增生。Westernblotting和免疫组化结果显示，AGTF能显著降低大鼠肾组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β蛋白和尿酸盐重吸收相关蛋白URAT1、GLUT9的表达（P＜0.05、0.01），显著升高尿酸盐排泄相关蛋白ABCG2的表达（P＜0.05、0.01）。结论AGTF对HUA肾功能损伤大鼠具有较好的保护作用，其作用机制可能与降低TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β表达，抑制炎症反应，并调节尿酸盐转运蛋白URAT1、GLUT9和ABCG2的表达，促进尿酸代谢有关，与分子对接预测结果一致。
肾功能损伤是高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）临床最常见并发症之一，体内血尿酸产生过多或肾脏排泄尿酸减少，尿酸盐达过饱和状态而沉积于肾间质和输尿管，从而引起肾脏病变[1]。HUA肾功能损伤主要病理学改变为慢性肾间质、肾小管病变，并伴有局部炎症反应发生[2]。近年来，HUA并发的肾功能损伤发病率呈升高趋势，男性患者多于女性，其发病隐匿，早期无明显临床症状。临床上常用的化学药物多为别嘌醇、非布司他和苯溴马隆等[3]，通过抑制尿酸生成和促进尿酸排泄来改善尿酸代谢，但对并发的肾功能损伤尚无确切疗效。糖尿病、HUA等代谢性疾病是中医药防治的优势病种，中医药及少数民族医药对其相关并发症具有较好的临床治疗优势。藤茶，又称莓茶、龙须茶、客家白茶，由显齿蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang的嫩枝叶加工而成，具有清热解*、活血通络的功效[4]，主要分布于四川、贵州、湖南、湖北、广西等少数民族地区[5-6]，具有药食同源之性。藤茶含有*酮类[7]、多糖类[8]、酚类[9]、氨基酸[10]等多种活性成分，其*酮类成分含量最为丰富，主要有二氢杨梅素、藤茶素、槲皮素、杨梅素等，其中二氢杨梅素的质量分数高达35%，被认为是藤茶发挥保健功效的重要药效物质基础[11-12]。现代药理学研究表明，藤茶及其总*酮部位具有抗氧化[13]、降血压[14]、调血脂[15]、抗动脉粥样硬化[16]、心血管保护[17]、抗肝癌[18]等药理作用。课题组前期通过对藤茶民族习用地区大量走访和临床实践反馈后发现，藤茶作为药食两用植物，在多个少数民族地区均有治疗痛风和慢性肾炎的民间习用和文献记载情况[19]，但其治疗HUA肾功能损伤的作用机制相关研究较少。因此，本研究采用分子对接技术，综合藤茶总*酮中代表性活性成分，深入探讨药物组分与尿酸生成和排泄相关蛋白靶点的相互作用，并建立腺嘌呤联合乙胺丁醇致HUA肾功能损伤大鼠模型进行验证，系统探讨藤茶总*酮提取物对HUA肾功损伤的保护作用，以期为少数民族地区药食资源藤茶的进一步保健开发提供科学依据。1材料
1.1动物
SPF级雄性Wister大鼠50只，7周龄，体质量～g，购于四川省成都达硕实验动物研究中心，许可证号SCXK（川）-。动物饲养于西南民族大学药学院SPF级动物实验室，温度（24±2）℃，相对湿度（55±5）%，每12小时昼夜间断性照明，适应性饲养1周。动物实验经西南大学药学院实验动物伦理委员会批准（批准号-05）。
1.2药材
藤茶药材市售，产地湖南省张家界市，经西南民族大学顾健教授鉴定为葡萄科植物显齿蛇葡萄A.grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang的干燥嫩枝叶。藤茶粉碎后过40目筛，称取适量干燥藤茶，按1∶10加入蒸馏水，于℃回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，减压蒸发浓缩得浸膏。将浸膏用D-大孔树脂吸附，水洗近无色后，用95%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得纯化物，干燥即得藤茶总*酮（totalflavonoidsfromA.grossedentata，AGTF）。以二氢杨梅素为对照品，采用AlCl3比色法测定AGTF质量分数为84.16%。1.3药品与试剂
别嘌醇片（批号，国药准字H，规格0.1g/片）购自合肥九联制药有限公司；二氢杨梅素对照品（批号MUST-，质量分数≥98%）购自成都曼思特生物科技有限公司；腺嘌呤（批号D，质量分数≥99.5%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸乙胺丁醇片（批号T19B，规格0.25g/片）购自杭州民生药业有限公司；尿酸试剂盒（批号0407）、*嘌呤氧化酶（xanthineoxidase，XOD）试剂盒（批号0330）、腺苷脱氨酶（adenosinedeaminase，ADA）试剂盒（批号0403）、肌酐试剂盒（批号1021）、尿素氮试剂盒（批号1022）均购自南京建成生物工程研究所；尿酸重吸收转运体1（uricacidreabsorptiontransporter1，URAT1）抗体（批号bs-R）、葡萄糖转运蛋白9（glucosetransporter9，GLUT9）抗体（批号bs-R）、三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2（adenosinetriphosphatebindingcassettetransporterG2，ABCG2）抗体（批号bs-R）、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）抗体（批号bsR）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）抗体（批号bsR）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗体（批号bsR)、转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）抗体（批号bsR）、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（批号bsG-HRP）均购自北京博奥森生物技术有限公司；苏木素染液（批号G5-1）、伊红染液（批号G1）购自武汉赛维尔生物技术有限公司；β-actin抗体（批号）购自美国Proteintech公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.4仪器
CYT5M型多功能全波长酶标仪（美国BioTek公司）；H-W型高速微量离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Mini-SubCellGTCell型水平电泳系统、ChemiDoc免染蛋白印迹系统（美国Bio-Rad公司）；BMJ-Ⅲ型包埋机（常州郊区中威电子仪器厂）；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）；BA型数码三目摄像显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）。2方法
2.1AGTF主要活性成分与疾病相关靶点的分子对接
尿酸代谢涉及尿酸生成（即嘌呤分解代谢）与尿酸排泄等多个途径。XOD和ADA是尿酸生成途径中的重要靶蛋白，也是抗HUA药物设计的关键靶点；URAT1、GLUT9和ABCG2是促尿酸排泄药物作用的靶点[20-22]。以上靶点对AGTF潜在药效物质的筛选及临床诊断、治疗具有重要意义。根据文献报道[11-23]，将藤茶总*酮提取物中发挥药理作用的主要活性成分二氢杨梅素、杨梅素、槲皮素和藤茶素作为配体，以URAT1、GLUT9、ABCG2、XOD和ADA蛋白为受体，分别进行分子对接，并以临床上降尿酸首选药物*嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇作为阳性对照[24]。2.1.1化合物的处理运用PubChem数据库（