背景
30-40%以上的尿酸是通过肠道排泄的，肠上皮功能障碍干扰了尿酸的排泄。已有研究报道肠道微生物群落参与高尿酸血症，但高尿酸血症时肠道免疫功能的变化及其机制尚不清楚。
方法
采用CRISPR/Cas9技术构建尿酸氧化酶(Uox)基因敲除(Uox-/-)小鼠高尿酸血症模型。通过测定生化指标的变化来评估脂肪代谢。用4-kDa荧光素异硫氰酸酯标记的右旋糖酐评估肠屏障功能。同时进行16SrRNA测序，检测小鼠粪便中肠道微生物群落的变化。辅助RNA测序、Westernblot、RTq-PCR、ELISA和免疫组织化学分析检测肠组织、血清、肾脏、肝脏、胰腺和血管中的基因转录、免疫细胞数和细胞因子水平。实验材料
选用C57BL/6J小鼠，通过CRISPR/Cas9技术构建了Uox基因敲除(Uox-/-)小鼠高尿酸血症模型。6只纯合子小鼠(Uox-/-)和6只野生型小鼠(WT)用于实验。收集粪便样本，并在15周龄时将小鼠处死(每组6只)，取肾、肝、血管、胰腺、空肠、回肠和结肠标本。实验方法
16SV1-V3
测序平台
IlluminaHiSeq
结果
1、高尿酸血症小鼠脂代谢紊乱
图1A表明高尿酸血症模型小鼠和野生型小鼠的血清尿酸水平有显著性差异。高尿酸血症小鼠血清TC和LDL水平升高，提示心血管疾病和中风患者有患高尿酸血症的风险(图1B，C)。
同时观察到高密度脂蛋白(HDL)水平升高(图1D)，表明脂质代谢紊乱。然而，在高尿酸血症和WT小鼠之间没有发现甘油三酯和血糖水平的变化(图1E，F)。高尿酸血症小鼠肾脏形态明显异常，包括肾单位塌陷、坏死、间质水肿、炎细胞浸润(图1G)。
图1高尿酸血症小鼠脂代谢紊乱
2、高尿酸血症小鼠的微生物群落组成发生改变本研究结果表明，高尿酸血症小鼠存在微生物群落失调。基于未加权UniFrac距离的NMDS结果显示了两个独立的集群，说明高尿酸血症小鼠和野生型小鼠具有高度不同的群落组成(图2A)。用Lefse进一步分析两组间不同的菌群。如图2B、C所示，在高尿酸血症小鼠中，类杆菌、别杆菌和肠道炎症相关菌群(如泽泻属和副杆菌属)的丰度显著增加，而主要的产生丁酸的菌群(如梭菌和保护性细菌乳杆菌)和厌氧菌(如念珠菌和芽孢杆菌属)的数量减少。最后，用皮尔逊相关系数(P0.05)分析尿酸水平与菌群丰度的相关性，初步验证微生物群落与高尿酸血症的相关性。本研究共鉴定出与尿酸呈正相关的5个菌群(别杆菌属、泽泻属、丁状弧菌属、类杆菌属和巴氏杆菌属)和呈负相关的3个菌群(梭状芽孢杆菌_XlVa属、伯克霍尔德氏菌属和克里斯滕森氏菌属)。与尿酸呈正相关的菌群也与肠道炎症有关。这些结果表明，微生物群落的改变是肠道炎症的标志。
图2高尿酸血症小鼠出现微生物失调3、肠道微生物群落紊乱伴随肠道免疫高尿酸血症小鼠体内炎症相关菌群的数量都有所增加，尤其是在肠道中。通过RNA-seq了比较野生型小鼠和高尿酸血症小鼠肠道中mRNA的表达水平，以探讨肠道微生物群落对肠上皮功能的机制的影响。如图3A，B所示，Toll-like受体通路及炎症相关的TNF和NF-kappaB信号通路均被富集。此外，与细菌感染性疾病有关的几种DEGs（差异表达基因），如金*色葡萄球菌、沙门氏菌和致病性大肠杆菌也得到了富集。而且炎症性肠病和细菌侵袭相关的DEGs也显著高表达。后续用RTq-PCR证实了这一结果。图3高尿酸血症小鼠肠道炎症加重A-E我们评估了回肠、空肠和结肠组织中微生物模式识别受体水平的变化。如图3C-E所示，在高尿酸血症小鼠中表达最强的基因是TLR2、TLR4和TLR5，这意味着肠道生物失调。TLR2、TLR4、TLR5和NLRP3的表达明显异常，尤以空肠为甚。然而，TLR4在回肠、空肠和结肠中的蛋白水平保持不变。空肠中仅TLR2蛋白水平升高，结肠中TLR5蛋白水平升高(图3F-H)。用Westernblot分析进一步测定促炎细胞因子的水平。如图3I、J所示，肿瘤坏死因子-α在回肠、空肠和结肠中的表达增强。此外，炎症性肠病相关因子IL-1b在回肠、空肠和结肠中的水平也升高。这些数据表明，高尿酸血症时微生物群落组成的变化伴随着肠道免疫功能的改变。图3高尿酸血症小鼠肠道炎症加重F-J4、以肠屏障受损和淋巴细胞浸润为特征的高尿酸血症为了进一步研究肠道炎症和上皮屏障功能障碍与高尿酸血症的关系，分别于6、9、12、15周检测血清FD4浓度。如图4A所示，高尿酸血症小鼠在不同时间点的共同特征是受损屏障。值得注意的是，无论是高尿酸血症组还是野生型组，老年小鼠的肠道通透性都较高。说明高尿酸血症和WT小鼠的肠通透性均随年龄增长而增加。
然而，高尿酸血症组的升高很明显，而野生型组的升高幅度较小。提示年龄可能使高尿酸血症小鼠肠屏障功能障碍加重。肠通透性增高与尿酸水平呈正相关(r=0.79，P0.01)，提示肠通透性增高可能与高尿酸血症有关(图4B)。总之，这些观察表明，高尿酸血症的特征是肠道屏障受损。取上皮组织进行HE染色，进一步观察肠粘膜的病理变化，发现回肠、空肠和结肠的肠道结构没有明显差异。进一步检查了肠中炎性细胞的浸润情况，与野生型小鼠相比，高尿酸血症小鼠的回肠、空肠和结肠有明显的淋巴细胞(CD3+)浸润，表明淋巴细胞对肠上皮细胞的浸润。
图4高尿酸血症与肠屏障功能障碍相关5、肠屏障受损的分子机制通过评估上皮紧密连接蛋白的表达，以进一步研究肠屏障受损的分子机制。检测occludin和ZO-1的表达。如图5A-C所示，occludin基因仅在空肠中表达较低，而ZO-1的表达水平未受影响。在回肠和空肠中，occludin蛋白的表达明显减弱，而在结肠中的表达略有变化。紧密连接蛋白occludin和claudin-1在空肠和结肠的表达也较低(图5D，E)。本研究进一步分析了促凋亡和抗凋亡基因的表达，发现促凋亡基因Bax在回肠和空肠中的表达显著增加，而抗凋亡基因Bcl21在回肠中的表达降低。图5高尿酸血症改变紧密连接蛋白的表达6、屏障受损与全身性炎症增加有关这项研究进一步探讨了受损的屏障是否会导致微生物产物进入循环系统。一直以来，高尿酸血症小鼠的循环内*素（LPS）水平高于WT小鼠。值得注意的是，高尿酸血症的内*素水平也随着年龄的增长而增加(图6A)，这与肠道通透性的增加同步。但与高尿酸血症小鼠相比，WT小鼠内*素水平在不同时间点均无明显升高。肠道通透性与循环内*素水平呈密切正相关(图6B)。这些发现表明，一种受损的屏障推动了LPS进入系统循环。
LPS可引发一系列促炎反应。因此，我们假设高水平的LPS可能会引起明显的全身性炎症。如图6C所示，高尿酸血症小鼠中TNF-α循环水平升高。然而，血清IL-1b水平并没有增加(图6D)。进一步假设，肠道屏障受损导致微生物产物和致病因子的系统性传播增加，可能会对多个器官产生直接影响。检测各脏器促炎细胞因子TNF-a和IL-1b水平。如图6E，F所示，TNF-α在肾脏和胰腺中显著升高，而在肝脏和血管中无明显变化。然而，IL-1b仅在肾脏表达上调。此外，还发现巨噬细胞(CD68+)在血管内有明显的浸润区域(图6G)。这些数据显示肾脏、胰腺和血管的炎症程度较低。
图6高尿酸血症增加全身性炎症结论
本研究在阐明发生高尿酸血症时肠道免疫功能的变化和机制，以及高尿酸血症与肠屏障功能障碍的相关性方面具有创新性。此外，肠道屏障的功能障碍和宿主-微生物组串扰的失衡在高尿酸血症和相关代谢综合征的加重中起着至关重要的作用。本研究从新的角度提出了治疗高尿酸血症的新靶点。文：TanbnAnna排版：市场部文献下载：